• O KSICHTu
• Přihláška
• Aktuální ročník
• Minulé ročníky
• Akce KSICHTu

Čím, řekněte mi čím…

Laboratoře forenzní chemie většinou nebývají plné nejnovějších výstřelků laboratorní techniky, které se běžně objevují v seriálech Kriminálka XYZ. Detektivové mají rádi věci dobře vyzkoušené a s puncem pravdivosti, což je u nových metod vždy otevřená otázka. Čím víc se toho časem v chemii mění, tím více zůstávají věci stejné.

První forenzní laboratoř založil v roce 1910 Edmund Locard se dvěma přístroji – mikroskopem a spektrofotometrem. A tyto přístroje jsou pilíři forenzní analýzy dodnes. Jen k nim přibyly i další spektroskopické metody jako infračervená spektroskopie a rentgen. Dalším vylepšením jsou dělicí analytické metody jako je například plynová chromatografie s hmotnostním spektrometrem (GC-MS), dokonce i nukleární magnetická resonance (NMR) a skenovací elektronová mikroskopie (SEM) si pomalu nacházejí cestu do některých forenzních laboratoří. V každé forenzní laboratoři ale najdete alespoň jeden mikroskop, a proto začneme právě s ním.

Viděti mnoho – mikroskopické techniky

Mikroskopické techniky se používají ve forenzní analýze už od dob Sherlocka Holmese a Edmunda Locarda a to na mnoha místech – pokaždé, když je potřeba si něco prohlédnout zblízka, ať už jde o vlákna, krystalky jedů nebo kontrolu vzorků z místa činu.

Porovnávací mikroskop

Na rychlé třídění se používají porovnávací mikroskopy se přibližně čtyřiceti­ná­sob­ným zvětšením. Jsou to vlastně dva mikroskopy v jednom spojené můst­kem. Při pohledu do porovnávacího mikroskopu pak vidíme najednou dva vzorky (obr. 1). Před začátkem používání počítačového zpracování v daktyloskopii se právě takto porovnávaly i otisky prstů.

Pohled do porovnávacího mikroskopu. V tomto případě se zdá, že jsme našli správný vzorek tkaniny.

Mikroskopy s polarizovaným světlem

Na trošku podrobnější zkoumání, především vláken a vlasů, se používají mikroskopy používající polarizované světlo. To získáme z obecného světla pomocí polarizačního filtru, který propouští světlo polarizované jen v jedné rovině (obr. 2).

Vznik a použití polarizovaného světla

Pokud by světlo procházelo neuspořádaným vzorkem, jakým je například sklo, pak se rovina polarizovaného světla nestáčí a při uspořádání dle obr. 2 bude vidět jen černá plocha. Ale jakákoliv organizovanost vzorku rovinu polarizovaného světla stáčí. A tato organizovaná místa pak září na černém pozadí (obr. 3).

Křížení syntetických vláken pod mikroskopem s polarizovaným světlem

Moc světla – spektroskopie

Spektroskopie je metoda založená na interakci elektromagnetického záření se vzorkem. Z tohoto pohledu je vlastně i mikroskopie spektroskopií, neboť používá interakci viditelného záření se vzorkem a jako detektor použije lidské oko. Ale nejen viditelné světlo je záření a lidské oko není zas až tak dobrý detektor, který se bude chovat za všech okolností stejně, aby by zajistilo reprodukovatelné výsledky.

U kolébky spektroskopie stál sir Isaac Newton se svým hranolem a objevem monochromatického světla. Také si všiml, že čím čistější monochromatické světlo získává, tím slabší je jeho intenzita, což je pravda, kterou překonaly až lasery a synchrotrony. Nicméně první spektrometr vytvořili Kirchhoff a Bunsen v roce 1860 (obr. 4). Bunsen k tomu řekl: Určení jednoho prostého faktu je mnohem důležitější, než ta nejkrásněji sestavená teorie. Tahle slova by mohla být mottem forenzní chemie, nemyslíte?

Dobová karikatura Bunsena

Spektroskopie se dá rozdělit podle několika měřítek. Prvním měřítkem může být typ interakce záření s hmotou. Atom může záření pohltit (absorpce), nebo může naopak uvolnit energii ve formě záření (emise), na konec může záření pohltit a po čase ho opět vypustit (fluorescence a fosforescence)¹).

Druhým měřítkem může být použitá vlnová délka a tedy typ záření. Rozdě­lení podle tohoto měřítka ukazuje tabulka 1.

Povšimněte si, že se zkracující se vlnovou délkou záření se zvyšuje jeho energie a také dopad záření na atomy, či molekuly je drtivější. Zatímco radiové vlny svým dopadem ovlivní jen orientaci jaderného spinu a molekule vlastně nic neudělají, gamma záření je schopno rozmetat i atomová jádra.

Ale detektivové nepotřebují rozmetávat atomová jádra. Vystačí si s prvkovou analýzou, kterou poskytuje RTG záření, případně s UV/VIS nebo IR spektroskopií. Fluorescence se používá například k zobrazování otisků a také k DNA značení při hledání otcovství.

UV/VIS – spektroskopie ve viditelné a ultrafialové oblasti

UV/VIS spektroskopie je klasická metoda, která už má svou chvíli slávy za sebou. Její zaměření na barvy a inkousty má jednu zásadní vadu – signál posléze nestačí k úplné identifikaci vzorku, je příliš obecný. Ovšem obecnost má i jednu výhodu – UV/VIS spektrofotometr² může sloužit jako detektor v dělicích aparaturách z následující kapitoly.

IR – infračervená spektroskopie

IR spektroskopie je zásadně kvalitativní metoda, která dává velice přesnou identifikaci isolované látky. IR spektrum totiž obsahuje tzv. fingerprint region mezi 1300 až 100 cm^-1, který je pro každou látku typický a při analýze se použije porovnání naměřeného spektra se spektrem drogy, případně vlákna v knihovně³. Protože IR záření je zachytáváno sklem a v některých oblastech spektra i vzduchem, musí se vzorek vložit do bromidu draselného a stlačit, aby se vyhnal překážející vzduch a měření pak probíhá ve vakuu.

ATR – zeslabený úplný odraz

Zajímavou modifikací IR spektroskopie je tzv. zeslabený úplný odraz (Attenuated Total Reflectance). Infračervený paprsek se pošle pod správným úhlem do upraveného hranolu diamantu, germania, ZnS, ThBr, nebo ZnSe. Protože mají tyto látky vyšší index lomu než okolní vzduch, dochází u nich k úpl­nému odrazu a paprsek vlastně postupuje uvnitř hranolu, podobně jako uvnitř optického kabelu (obr. 5). Změnou oproti optickému kabelu je přitlačení hranolu na vzorek, kdy se část paprsku ztratí při dotyku se vzorkem a dojde tedy k zeslabení odraženého paprsku.

Attenuated Total Reflectance, infračervené záření je absorbováno jen malou vrstvou vzorku

Toto zeslabení je naštěstí pro analytiky způsobeno absorpcí a získáme tedy infračervené spektrum vzorku. Sice jsou trošku jiná, než standardní infra­čer­vená spektra, což je způsobeno malou hloubkou, do které se vlastně díváme (kolem 1 μm), ale vzhledem k zjednodušení přípravy vzorků se to vyplatí a knihovny ATR spekter také postupem času porostou.

Ramanova spektroskopie

Ramanova spektroskopie je další metoda pracující s vibracemi molekul, tedy v infračerveném pásmu. Tato technika používá rozptyl laserového paprsku při interakci s látkou. Nejčastěji laserový paprsek excituje elektron v základním stavu, který při návratu do základního stavu vyzáří foton se stejnou vlnovou délkou, ale v zásadě libovolným směrem. To je tzv. Rayleighův rozptyl, který nenese žádnou analytickou informaci. Tu ale nesou fotony s jinou vlnovou délkou, které vznikají buď z excitovaných elektronů, které pak spadnou do základního stavu – Anti-Stokesovy fotony s větší energií než byla energie fotonů laserového paprsku, nebo z elektronů, které byly původně v základním stavu, ale deexcitovaly se jen částečně – tzv. Stokesovy fotony (obr. 6).

Přechody elektronů a tomu odpovídající spektrální čáry

Ramanova spektroskopie se uplatňuje při analýze drog a farmaceutik, barev, inkoustů i vláken. Využití našel i například při ověřování pravosti mapy Vinlandu (obr. 7), která měla dokázat, že Vikingové byli v Americe před Kolumbem. Objevena byla v roce 1957, a jak už to u podobných objevů bývá, okamžitě byla zpochybněna její autenticita. Byla mnohokrát zkoumána, takže například Cahill rentgenem ukázal, že byla kreslena jen jednou a to na pergamenu z roku 1434, jak pro změnu určili Donahue, Olin a Harbottle pomocí uhlíkového datování. Zbývala otázka, čím byla mapa kreslena?

Mapa Vinlandu, nebo také Mappa Mundi, Yale University Press

Původní středověké dokumenty psané černým inkoustem často obsahovaly gallotanát železitý, který se pomalu šířil z inkoustu do pergamenu pod ním. Migrující železo po čase způsobuje zažloutnutí a zkřehnutí pergamenu a vytvoří žluté okraje kolem černého písma. Brownová a Clark použili Ramanovu spektroskopii a zjistili, že černý inkoust obsahuje především uhlík a pergamen mapy nevykazuje známky poškození předpokládaného u gallotanátového, nebo také duběnkového inkoustu. Zvláštní přitom je, že kodex Historia Tartarum, se kterým byla mapa poprvé nalezena a který je autentický a nezpochybňovaný, byl psán běžným duběnkovým inkoustem. Zdá se, že padělatel nejprve nakreslil žluté linie, do kterých poté vepsal tenčí linku černým inkoustem. Na druhou stranu Cahill proměřil vzdálenosti okrajů černé a žluté linie a nejsou větší, než 100 μm, což zase nahrává teoriím o pravosti mapy, protože takové přesnosti se jinak špatně dvojím kreslením dosahuje… Nu, zdá se, že příběh mapy Vinlandu ještě úplně neskončil.

Atomová spektroskopie aneb elementární analýza

IR spektroskopie sice forenzní analýze dominuje, ale pro detekci těžkých kovů, například z jedů, případně ze zbytků střeliva jsou zapotřebí jiné nástroje.

Jedním z nich je atomová absorpční spektroskopie (AAS), druhým je fluorescence rentgenových paprsků (XRF). Obě pracují s přechody vnitřních elektronů, tj. elektronů, které se neúčastní vazeb, ale jsou přimknuté blíže k atomovému jádru. Vnitřní elektron se nejdříve excituje a při návratu zpět na původní energetickou hladinu vyzáří foton. Díky tomu, že každé atomové jádro má jinou sadu těchto elektronů s trošku jinými energiemi, sledováním vyzá­ře­ných elektronů získáváme informaci přímo o přítomném jádře a tedy i o typu atomu. Obě metody pracují se záchytem záření, ale liší se způsobem excitace, která k přechodům vnitřních elektronů vede.

AAS – atomová absorpční spektroskopie

AAS používá lampu s katodou potaženou kovem, který chceme stanovit. Ta vysílá fotony, které zachycují stejné atomy, jaké jsou ve vzorku. Vzorek excitujeme buď plasmou, nebo plamenem. Mezi plamen a detektor dáme monochromátor, který nastavíme tak, aby propustil světlo se správnou vlnovou délkou (obr. 8). Pokud jsou v plameni příslušné excitované atomy, záření je pohlceno a my uvidíme pokles intenzity, který bude přímo úměrný koncentraci atomů v našem vzorku.

Experimentální uspořádání AAS

XRF – rentgenová fluorescence

XRF používá k excitaci proud rentgenového záření. To je schopno excitovat vnitřní elektron, který dokonce může opustit atom. Ve chvíli, kdy se uvolní vnitřní elektron, elektrony z vyšších slupek spadnou na jeho místo a uvolní přebytečnou energii ve formě fotonu, která bude nižší, než byla energie původního rentgenového fotonu. Elektrony mohou popadat kaskádovitě, takže se může objevit spektrum různých fotonů a toto právě toto fluorescenční spektrum se používá k identifikaci atomu. Ač to tak z popisu odlétajících elektronů nemusí vypadat, XRF je nedestruktivní metoda, která se dá použít ke studiu povrchu vzorků.

Fungující kočkopes – mikrospektrofotometrie

Použití srovnávacích mikroskopů má jednu vadu – ty dvě červené barvy, které vypadají stejně, se ve skutečnosti mohou lišit ve složení. A naopak spektrální metody mají tu vadu, že sice změříme spektrum, ale jen celého vzorku a my bychom potřebovali znát jen jeho část a nejlépe ji i vidět. Jak je ale spojit?

Řešením se stala mikrospektrofotometrie (MSF), která v sobě spojuje mikroskopické i spektroskopické metody, přičemž toto spojení donedávna naráželo především na technická omezení – na konstrukci čoček a na slabé zdroje záření. Konstrukce čoček se napravila používáním elektromagnetických cívek, pří­padně naleštěných ocelových zrcadel místo skleněných a o dostatečně silné zdroje záření se postaraly lasery.

Hlavní výhodou MSF pak je, že můžeme zkoumat vzorky do většího detailu, třebas jen jedno vlákno a rovnou si vzorek, na který se díváme, proklepnout i spektrálně. Jednotlivé mikrometody našly použití pro:

• mikro-UV/VIS pro nedestruktivní analýzu vláken, inkoustů a barev,
• mikro-ATR pro drogy a barvy,
• mikro-Raman pro pigmenty a inkousty.

Mikroelementární analýza je trošku zvláštní případ a je vlastně vedlejším produktem práce skenovacího elektronového mikroskopu (SEM), který skládá obraz objektu pomocí proudu elektronů, které se na vzorku rozptylují. Elektrony atomy nabíjejí, ale také nárazy elektronů na atomy⁴ vytváří rentgenové záření, jež nám prozradí, jaké atomy ve vzorku jsou.

Rozděl a panuj – složené techniky

Takřka všechny předchozí metody se nejlépe uplatní, pokud je vzorek jednoduchý a skládá se jen z pár sloučenin. Opak bývá pravdou. Aby se usnadnila analýza, používají se kombinované techniky, které využívají dělicí metodu spolu s metodami detekčními, jako jsou například detekce vodivosti, případně UV/VIS spektroskopie. Dělicí metody jsou nejčastěji založené na chromatografii, tedy dělení látek rozdílným zpožďováním na rozmezí stacionární fáze a mobilní fáze jako tomu bylo v minulém dílu seriálu v případě chromatografie na tenké vrstvě – TLC.

Další možností jsou elektroforetické metody založené na pohyblivosti iontů. Ionty jsou zadržovány na stacionární fázi, případně kapilárou a dochází k dělení podle velikosti iontu a jeho celkového náboje.

Elektroforetické metody

Jejich použití je poměrně pestré – zatímco aplikace kapilární elektroforézy (CE) ovládly DNA otisky (DNA fingerprinting nebo také DNA typing) a díky své nenáročnosti a výhodné ceně si pomalu brousí zuby na toxikologii, elektroforéza v plynné fázi, nebo také ion mobility spectrometry (IMS) je hlavním nástrojem ve vyhledávání výbušnin a drog na letištích, přístavech a hraničních přechodech.

V IMS se malý vzorek vzduchu nejprve ionizuje pomocí β-zářiče ⁶³Ni. Protože se pracuje za atmosférického tlaku, vzniklé ionty jsou obklopeny vodní párou, které zvýší váhu iontů. Načež se na ionty a molekulární klastry uplatní elektrické pole a ionty se podle něj začnou pohybovat. Dělení podle velikosti pak obstarává protiproud netečného plynu a malé ionty dopadnou na detektor dříve, než velké iontově-molekulové klastry. Výstupem je pak graf intenzity proti času. Mobilitní spektrum sice nestačí k úplné identifikaci látky, ale může okruh hledání výrazně zúžit.

Chromatografické metody

Kromě chromatografie na tenké vrstvě, kterou jsme poznali minule, se po­u­ží­vají dvě další chromatografické metody. Výhodou vysokoúčinné kapalné chromatografie (HPLC⁶) je její proměnlivost – její dělicí schopnost totiž značně závisí na použité koloně a použitých rozpouštědlech, které se navíc dají v prů­běhu analýzy vzájemně míchat. HPLC si našla své použití hlavě při stanovování netěkavých látek jakou jsou větší polymery typu proteinů nebo cukrů, nebo tepelně nestabilních látek jako je například LSD či výbušniny.

Plynová chromatografie (GC) používá místo rozpouštědla nosný plyn a používá se především pro stanovování těkavých, případně tepelně stabilních látek – drog, případně urychlovačů hoření (obr. 9).

Experimentální uspořádání plynové chromatografie

Jak v HPLC, tak v GC potřebujeme rozpoznat, že látka už kolonou prošla a nejlépe i určit, jaká látka to byla. Jako detektory se často používá spektroskopických metod, ale více popisnou metodou je hmotnostní spektrometrie (MS).

MS – hmotnostní spektrometrie

Hmotnostní spektrometrie pracuje s dělením podle poměru m/z, kde m je hmotnost a z je náboj fragmentu. Vzorek se nejprve musí ionizovat, což často vede k fragmentaci molekuly a vzniklé ionty se posléze dělí pomocí elektromagnetického pole. Získáme pak spektrum jednotlivých hmotností dělených nábojem. Dělení probíhá ve vakuu a možnosti dělení jsou v podstatě dvojí.

Zaprvé jde o urychlování elektrickým polem, takže fragmenty s menším poměrem m/z doletí do detektoru dříve, záznam tedy závisí na času letu iontu, a název tohoto typu spektrometru je tedy Time-of-flight (TOF).

Druhý způsob využívá magnetismus, neboť se dráha nabité částice v magnetickém poli zakřivuje přímo úměrně intenzitě magnetického pole. Nejčastěji dráhu iontu upravuje proměnlivé magnetické pole mezi tzv. kvadrupólem (obr. 10).

Experimentální uspořádání hmotnostního spektrometru s kva­dru­pólem, vybírajícím postupně ionty ze vzorku. Ostatní ionty se zachytí na stěnách kvadrupólu.

Slovo závěrem

Pokud jste to dočetli až sem, budete se mnou jistě souhlasit, že forenzní chemie používá značné množství metod. Dokonce tolik, že se všechny do dnešního dílu nevešly. Proto si metody spojené s DNA necháme na příště do dílu Krvavé příběhy psané střelným prachem, kde se podíváme podrobněji i na střelivo, výbušniny a požáry. A vy si můžete připravit duběnkový inkoust k falšování Rukopisu Královédvorského podle tohoto dobového postupu:

Opatři stejné váhové množství duběnek a višňové pryskyřice, pryskyřici na­moč za dorůstajícího měsíce – 5. nebo 11. dne – do medoviny v množství, které se vejde do tří vaječných skořápek, nebo do vody a nech máčet dva týdny. Duběnky roztluč na prášek a prosej sítem. Pak vezmi nevelké železné desky a v počtu dvaceti nebo třiceti je pomocí provázku upevni na dřívko a zavěs do nádoby (s připravenou tekutinou). Míchej dvakrát denně po dva týdny. Pak přilij tři lžíce vína a dvě lžíce čerstvého medu. Inkoust slij tehdy, až získá černou barvu, když je nebe čisté a jasné. Vydrží pak dva nebo tři roky i déle.

Ale nejspíš postačí jednodušší návod:

Co nejsilnější vodní vývar z duběnek nebo dubové kůry slijeme v objemovém poměru 1:1 s 2% vodným roztokem chloridu železitého. Dostaneme velmi trvanlivý modročerný inkoust.

Literatura

1. Bell, Suzanne. Forensic Chemistry. 1st edition.: Pearson Education, 2006. 614 s. ISBN 0-13-147835-4.
2. LYLE, Douglas. Forensics for Dummies. 1st edition.: Wiley Publishing, 2004. 356 s. ISBN 0-7645-5580-4.
3. http://en.wikipedia.org – první místo, kam se je většinou vhodné se podívat.
4. Nikon Microscopy University
5. Úvod do mikroskopie
6. V první sérii KSICHTu byl seriál o jednotlivých spektroskopiích od Pavla Řezanky
7. T.A. Cahill, R.N. Schwab, B.H. Kusko, R.A. Eldred, G. Moller, D. Dutschke, D. L. Wick and A.S. Pooley., The Vinland Map, Revisited: New Compositional Evidence on Its Inks and Parchment. Analytical Chemistry 59 (1987): 829-833.
8. Donahue, D. J.; Olin, J. S.; Harbottle G. Determination of the Radiocarbon Age of Parchment of the Vinland Map. Radiocarbon 44 (2002): 45-52.
9. Brown, K. L. and Clark, R. J. H., Analysis of Pigmentary Materiále on the Vinland Map and Tartar Relation by Raman Microprobe Spectro­scopy. Analytical Chemistry 74 (2002), 3658-3661
10. Vše okolo písemnictví na diskuzním fóru tzv. živé historie, tj. rekonstrukce historických pracovních postupů.

1. Rozdíl mezi fluorescencí a fosforescencí je především v časové škále, na jaké se projevují. Zatímco fluorescence je přechod mezi povolenými stavy a tudíž jí nic nebrání ve vypouštění fotonů již za pár nanosekund, fosforescence je přechod zakázaný. Leč žádný zákaz nezadrží fotony věčně a tak se i fosforescence dočká svých fotonů, ale trvá jí to občas až minuty.
2. Proč vlastně používáme slovo spektrofotometr a ne spektroskop? Název spektrofotometru, případně zkráceně spektrometru poukazuje na fakt, že spektra jsou sbírána počítáním (metrikou), jak moc se změnila intenzita světla při průchodu vzorkem pro danou vlnovou délku.
3. Nemyslíme tím oblíbenou chobotničku, alias blob, spíše databázi spekter v počítači.
4. Nárazy elektronů kromě rentgenového záření vytvářejí i záporný elektrický náboj, který se ze vzorku musí odebírat, aby se další přilétající elektrony nezačaly elektricky odpuzovat. Vzorek tedy musí být vodivý. Pokud vodivý není, většinou se pozlatí atomární vrstvičkou zlata.
5. Zkratka HPLC dnes označuje high performance liquid chromatography, i když původně znamenala high pressure liquid chromatography.